血小板源性整合素及四跨膜蛋白富集膜索加剧严重炎症

前言

血小板在血栓炎症中的作用机制是当前免疫学和血液学领域的研究热点。2026年1月，德国维尔茨堡大学医院实验生物医学研究所Bernhard Nieswandt教授团队在《Science》（Q1，IF=45.8）上发表了一篇题为“血小板源性整合素及四跨膜蛋白富集膜索加剧严重炎症”的文章。重点结论如下：

① 研究通过光学显微镜分析危重COVID-19患者血涂片上的血小板形态时，发现了一种新的血小板源性结构——在约40%的样本中存在大量长度不一（可达30 μm）的四跨膜蛋白富集膜索（PITTs）。血小板源性整合素及PITTs，其在严重感染（如COVID-19、脓毒症）患者的血小板表面形成并脱落。

② PITT的形成由血小板整合素αIIbβ3在血管性血友病因子（vWF）或纤维蛋白等配体结合下触发，不依赖于经典的血小板活化途径，其结果是αIIbβ3/CD9复合物从血小板膜上被选择性“剥离”并形成膜索。

③ 脱落的PITTs能够锚定在白细胞（尤其是中性粒细胞）和内皮细胞上，直接激活中性粒细胞并加剧血管炎症，同时导致血小板自身粘附功能受损。这些事件引发了中性粒细胞内游离钙浓度（[Ca2+]i）的离散和短暂增加，表明中性粒细胞的活化。在脓毒症患者样本中，PITT形成普遍增加，血涂片中分离的PITTs数量高于对照，并且常伴有血小板-中性粒细胞复合物（PNCs）和微血栓增加。

④ 在临床层面，患者血小板表面CD41a（αIIbβ3）的表达水平与疾病严重程度（如SOFA评分、ARDS发生率）和死亡率呈负相关，CD41a最低四分位患者的不良结局风险显著增高。这为血栓炎症与出血倾向并存的临床现象提供了机制解释。

这项研究不仅揭示了一种全新的血小板介导的免疫放大机制，也为针对血栓炎症性疾病开发不损害血小板止血功能的靶向疗法提供了新思路。

文章摘要

背景： 整合素是一类异二聚体跨膜受体家族，它们将细胞外基质与细胞骨架连接起来，并在多种细胞类型中调节粘附、迁移和信号传导。血小板整合素αIIbβ3（亦称为GPIIb/IIIa）是研究最为深入的整合素之一，对于止血和血栓形成不可或缺。除了其在凝血中的既定作用外，血小板还参与炎症性和感染性疾病中免疫介导的组织损伤。

研究依据：由于介导血栓炎症的血小板效应机制尚不明确，我们试图理解αIIbβ3的作用及其结合如何导致血小板功能改变。

结果：在重症COVID-19、脓毒症或细菌感染患者的血涂片和组织样本中，我们观察到血小板形态和整合素表达的改变。具体而言，我们注意到存在细长的血小板源性膜索，这些膜索对αIIbβ3及其相关的四跨膜蛋白CD9呈强染色。我们将这些结构称为血小板源性整合素及四跨膜蛋白富集膜索（PITTs）。PITT形成增加的指标与循环血小板表面αIIbβ3/CD9水平降低相关。流式细胞术证实了这些受体的选择性丢失，而其他主要糖蛋白得以保留。使用人和小鼠血小板，我们证明在血流剪切下，血管性血友病因子（von Willebrand factor, vWF）或纤维蛋白与αIIbβ3的结合足以触发快速的整合素成簇和膜索形成，且不依赖于经典的血小板活化。PITTs保持附着在白细胞或内皮上，而血小板主体则发生脱离，并部分耗竭了αIIbβ3/CD9。我们构建了Itga2b-GFP（绿色荧光蛋白）敲入小鼠，并在体外对PITT形成进行了活体成像，同时通过体内小鼠研究证实了在内毒素血症、细菌性肺炎或SARS-CoV-2感染期间，αIIbβ3/CD9在PITTs中富集、从血小板主体脱离以及沉积在发炎的肺部。

PITT形成过程中未出现血小板脱颗粒、磷脂酰丝氨酸外翻或整合素活化，从而与经典的细胞外囊泡或活化诱导的细胞突起相区别。在体内，PITTs附着于中性粒细胞，触发钙流及活化标志物表达上调，提示其具有促炎功能。机制上，在急性肺损伤模型中，清除vWF或阻断αIIbβ3可显著抑制PITT形成、中性粒细胞浸润及组织损伤。临床上，脓毒症患者血小板CD41a表达水平（反映PITT释放程度）与SOFA评分、ARDS发生率及死亡率呈显著负相关；进一步分层分析显示，CD41a表达处于最低四分位数的患者，其不良结局风险显著增高。

结论：我们提出，PITTs作为血小板源性结构，在严重感染和炎症期间重新分布αIIbβ3/CD9库。通过锚定在白细胞和内皮细胞上，PITTs可能放大血管炎症和免疫活化，同时留下粘附功能受损的血小板。这一机制可以解释危重疾病中血栓炎症和出血矛盾共存的现象。 除了止血功能外，αIIbβ3可能作为一种促炎效应因子，塑造炎症性和感染性疾病中的免疫反应和临床结局。靶向PITT形成可能为调节血栓炎症而不损害血小板活性提供新的机会。

未活化血小板释放整合素及四跨膜蛋白富集膜索以促进血栓炎症。循环血小板可利用其主要粘附受体——整合素αIIbβ3，在止血程序和血栓炎症程序之间切换。在血管损伤部位，经典活化触发αIIbβ3的由内向外信号传导，促进纤维蛋白原结合、血小板粘附和血栓形成。在血栓炎症条件下，未活化的血小板产生PITTs，可附着于白细胞和内皮细胞，加剧炎症，而血小板主体则以部分耗竭αIIbβ3的状态脱离。静息；活化。

简介

血小板整合素αIIbβ3对止血、血栓形成和炎症至关重要。我们发现，在血流剪切下，vWF或纤维蛋白与αIIbβ3的结合触发了其在质膜延伸或“血小板源性整合素及四跨膜蛋白富集膜索”（PITTs）中的积累。PITTs保持锚定在白细胞或内皮细胞上，而部分缺失αIIbβ3的血小板主体则发生脱离。尽管仍能对刺激产生反应，但αIIbβ3缺失的血小板不能支持血栓形成。在感染和内毒素血症的小鼠模型中，PITTs促进了白细胞活化和血管炎症，而阻断αIIbβ3减少了免疫介导的组织损伤。在脓毒症、COVID-19或严重感染患者中，PITT形成和血小板αIIbβ3丢失与疾病严重程度和不良预后相关。我们提出，PITTs是一种促炎结构，在放大免疫反应的同时，导致血栓炎症性疾病中的血小板功能障碍。

整合素是一个普遍表达的异二聚体跨膜受体家族，它们将细胞外基质（Extracellular Matrix, ECM）与细胞骨架连接起来，并作为双向信号分子调节广泛的细胞功能，包括细胞粘附、迁移、铺展、分化、增殖和凋亡。在哺乳动物已知的24种整合素中，αIIbβ3（亦称为GPIIb/IIIa和CD41/CD61）作为血小板的主要整合素（每个血小板约50,000至100,000拷贝），具有范式意义，对其结构和功能的研究为整个整合素家族的生物学提供了开创性见解。

血小板是小的、无核的血细胞，对血管监视、止血和血凝块形成至关重要。血管损伤时，它们通过糖蛋白Ib-IX（Glycoprotein Ib-IX, GPIb-IX）和GPVI与暴露的ECM结合，随后发生活化和脱颗粒。可溶性激动剂，如5‘-二磷酸腺苷（Adenosine Diphosphate, ADP）、血栓烷A2（Thromboxane A2, TxA2）和凝血酶，通过“由内向外信号传导（inside-out signaling）”放大活化作用，并使αIIbβ3从低亲和力状态转变为高亲和力状态，从而介导牢固的粘附和聚集。配体结合也诱导αIIbβ3成簇和“由外向内信号传导（outside-in signaling）”，促进肌动蛋白重组和力的产生。后者对于稳定的血小板粘附、血栓固结和血块回缩至关重要。αIIbβ3在止血中的关键作用由Glanzmann血小板无力症（Glanzmann Thrombasthenia, GT）所证明，这是一种由αIIbβ3缺失或功能障碍引起的出血性疾病。

新出现的证据进一步支持αIIbβ3和血小板在血栓炎症状态中的关键作用，但其潜在机制仍不清楚。特别是，有证据表明在肺部炎症和ARDS中存在血小板功能改变，这些症状是严重急性呼吸综合征冠状病毒2（Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2, SARS-CoV-2）感染引起的重症COVID-19的标志。事实上，实验和临床数据都指向血小板在此情况下加剧肺部炎症的作用。在这项工作中，我们旨在阐明驱动这种炎症反应的血小板效应机制，并理解其活化如何与血小板功能改变相关联。

结果

危重感染患者循环血小板中αIIbβ3/CD9的丢失

通过光学显微镜分析危重COVID-19患者血涂片上的血小板形态时，我们观察到在约40%的样本中存在大量长度不一（可达30 μm）的膜索。在多个病例中，这些膜索与血小板主体脱离（图1A）。免疫荧光染色显示，这些膜索对αIIb（CD41a）呈强阳性，而GPIbβ（CD42c）则缺失（图1B）。在膜上，αIIbβ3与四跨膜蛋白CD9结合，后者调节其定位并支持活化。共染色证实了CD9在膜索中的存在（图1B和图S1）。这些结构在健康对照中基本不存在，表明它们的形成是对COVID-19严重疾病的特异性反应。鉴于血小板对玻璃的粘附主要由αIIbβ3介导，我们假设膜索的形成是通过锚定的αIIbβ3机械驱动的，导致富含αIIbβ3/CD9的膜索从血小板中分离出来。我们称这些细长的膜结构为血小板源性整合素及四跨膜蛋白富集膜索（PITTs）。

图1. 危重感染患者循环血小板中αIIbβ3/CD9的丢失。 （A）危重COVID-19患者的May-Grünwald-Giemsa染色血涂片，显示显然未活化的血小板形成显著的膜索。健康对照涂片中无此类膜索。（B）使用共聚焦荧光显微镜检测两名危重COVID-19患者血涂片中的长αIIbβ3+/GPIbβ-膜索。（C）危重炎症状态患者循环血小板中αIIbβ3和CD9的选择性丢失。（D）显示人血小板中αIIbβ3和GPIbβ分布的共聚焦图像最大强度投影。（E）比较小鼠血小板中αIIbβ3和GPIX分布的共聚焦图像最大投影。（F）用对照IgG或MWReg30处理的小鼠血小板的扫描电镜图像。（G）经MWReg30AF647处理的小鼠血小板的dSTORM图像，在分子水平证实αIIbβ3整合素成簇。

我们假设，如果PITTs形成数量足够多并发生脱离，患者体内的血小板将会耗竭αIIbβ3和CD9。我们通过流式细胞术分析了从危重COVID-19患者中分离的血小板表面受体水平，发现与47名健康对照相比，αIIbβ3（CD41a）和CD9数量减少，而CD42a（GPIX）水平保持不变（图1C）。尽管αIIbβ3和CD9部分丢失，但这些血小板显然处于静息状态，因为αIIbβ3活化报告分子PAC-1的结合和CD62P表面的暴露几乎不存在。这一发现促使我们将研究扩展到感染或脓毒症患者。在两个队列中，循环血小板的αIIbβ3和CD9表达均较低，而CD42a水平与健康对照相当（图1C）。为说明CD41a和CD9的同时丢失，我们进行了流式细胞术点图分析，证实了所有患者组中这两种标志物的平行减少。此外，前向散射（Forward Scatter, FSC）信号（细胞大小的指标）没有差异，提示血小板形态得以保留（图1C）。我们也在脓毒症患者的血涂片中观察到大量PITTs。因此，这些数据与严重感染和炎症期间血小板部分丢失αIIbβ3/CD9相一致，这些情况与异常血小板功能相关。

αIIbβ3在血小板膜中的高侧向迁移率

αIIbβ3在PITTs中的选择性富集提示该整合素在血小板膜内具有高侧向迁移率。为了研究这一点，我们将人血小板与Hip8AF647（一种与荧光团偶联的抗αIIbβ3单克隆抗体（Monoclonal Antibody, mAb））孵育，并通过整合素成簇作为其在膜中迁移率的读数进行评估。尽管Hip8不活化血小板，但它诱导了αIIbβ3在细胞表面特定膜区域成簇和积累（帽化），证实了先前的观察结果。使用另一种抗αIIbβ3 mAb也观察到类似效应，而针对GPIbβ、GPV或GPIbα的mAb则不诱导受体成簇。

为了进行机制研究，我们将这些发现扩展到小鼠血小板。与抗αIIbβ3 mAb MWReg30AF488孵育导致显著的αIIbβ3成簇，而不诱导细胞活化。超分辨率直接随机光学重建显微镜（Direct Stochastic Optical Reconstruction Microscopy, dSTORM）成像显示αIIbβ3定位在离散的膜斑块中，存在大面积的信号缺失区域。我们也未检测到肌动蛋白和微管蛋白细胞骨架结构的重大改变。其他抗αIIbβ3 mAb也引起类似的成簇，而针对GPIX、GPIbα、GPIbβ、GPV或GPVI的mAb则不诱导成簇。与此一致的是，其他大量表达的血小板受体，包括GPIb-IX-V亚基、GPVI和CD62P，尽管在血小板主体上染色强烈，但在PITTs中缺失。

我们发现αIIbβ3成簇发生在MWReg30结合后的几秒钟内。小GTP结合蛋白Arf6被认为参与αIIbβ3的运输和内吞作用。然而，在Arf6缺失和对照血小板中，MWReg30诱导的αIIbβ3成簇没有区别，即使在网格蛋白抑制剂Pitstop 1存在下也是如此。在整个观察期间（60分钟），MWReg30在未固定的野生型（Wild-Type, WT）以及Arf6缺失血小板表面仍可检测到。

图1. 通过组织学检。博来霉素

αIIbβ3快速且高度特异性地募集至延伸膜索

为了在没有抗体诱导成簇的情况下研究αIIbβ3的迁移性和向PITTs的分离，我们构建了表达绿色荧光蛋白（Green Fluorescent Protein, GFP）标记的αIIb（Itga2b-GFP）的小鼠品系。通过流式细胞术、荧光显微镜和蛋白质印迹（Western Blot）分析，可轻松在循环血小板中检测到标记的整合素。Itga2bGFP/GFP血小板对激动剂反应正常，并能完全在纤维蛋白原上铺展，表明GFP标记未破坏整合素信号传导。与MWReg30孵育诱导了整合素的成簇和帽化，证实了αIIbGFPβ3的高侧向迁移率。

图2. 血小板源性整合素及四跨膜蛋白富集膜索（PITTs）的形成。 （A至C）构建表达GFP标记整合素αIIb（CD41）的小鼠品系。（D）Itga2bGFP/GFP血小板在流室中流经纤维蛋白原包被PRIMO图案时的代表性图像。（E）Itga2bGFP/GFP血小板在流室中流经vWF包被PRIMO图案时的代表性图像。（F）突出显示PITT形成的时间序列图像。（G）Itga2bGFP/GFP血小板在流室中流经vWF包被PRIMO图案时的代表性图像，分别用对照Fab、功能阻断性抗GPIbα或抗αIIbβ3处理。（H）Itga2bGFP/GFP血小板在流室中流经纤维蛋白包被PRIMO图案时的代表性图像。（I）Itga2bGFP/GFP血小板在流室中流经MWReg30包被PRIMO图案时的代表性图像。（J和K）在MWReg30包被PRIMO图案上形成的固定血小板和PITTs的dSTORM图像。（L）显示从亲本血小板延伸出的长突起以及膜索断裂的扫描电镜图像。

利用这些小鼠，我们试图测试静息血小板在缺乏激动剂刺激的情况下，是否会在表面结合的配体上形成PITTs。为此，我们使用PRIMO无掩模紫外（Ultraviolet, UV）图案化系统生成了2 × 40微米的粘附场。我们将微图案包被上vWF或纤维蛋白原，并以1000 s-1的速率灌注来自Itga2bGFP/GFP小鼠的血液。只有少数血小板粘附到纤维蛋白原上，几乎检测不到膜索形成。相比之下，vWF包被的图案支持稳固的血小板粘附和频繁形成耐剪切的αIIbGFP+/GPIX-膜索。PITTs在血小板后缘形成，但αIIbGFP+/GPIX-膜索也会短暂地向血流方向的前端延伸。

在高剪切力下，血小板在vWF上的易位是由GPIbα介导的，先前报道这种相互作用会诱导形成薄层膜索，该过程依赖于剪切力。在我们的实验中，用抗GPIX抗体阻断GPIbα-vWF相互作用，消除了血小板粘附和PITT形成。相比之下，阻断αIIbβ3-vWF相互作用的抗αIIbβ3 JON/A-F(ab)2减少了PITT形成，但不影响血小板对vWF的栓系。

在损伤或炎症部位，凝血酶将纤维蛋白原转化为纤维蛋白，后者强烈促进血栓炎症，最近研究表明这一过程在重症COVID-19感染的病理生理学中很重要。纤维蛋白有效诱导了PITT形成，这些PITT总体上比在vWF上观察到的更长（可达20 μm），并且经常似乎连接两个血小板。用JON/A-Fab2阻断αIIbβ3强烈抑制了血小板在纤维蛋白上的附着和PITT形成。这些结果表明，αIIbβ3的结合和/或锚定，而非GPIbα，触发了PITT形成。

为测试单独的αIIbβ3结合是否足以诱导PITT形成，我们用MWReg30包被微图案，并以1000 s-1的流速灌注来自Itga2bGFP/GFP小鼠的血液。血小板被迅速捕获并在后缘延伸出长的PITTs，有时脱离并留下分离的PITTs（Detached PITT, dPITT）。正如我们观察到的粘附在vWF上的血小板一样，也形成了短暂的前向αIIbGFP+/GPIX-膜索，但可能由于缺乏锚定点而迅速回缩。αIIbβ3和CD9在(d)PITTs中富集，而GPIb-IX和其他主要表面受体极少存在。扫描电子显微镜（Scanning Electron Microscopy, SEM）证实了dPITTs的存在，并且形成PITT的血小板仍然是盘状的，表明它们处于静息状态。

我们通过联合使用EGTA-BAPTA-AM或ASA-腺苷三磷酸双磷酸酶（Apyrase）-前列环素I2（Prostaglandin I2, PGI2）来抑制“经典”血小板活化途径，发现这并不损害在纤维蛋白或MWReg30上的PITT形成。PITTs对αIIbβ3高亲和力构象、CD62P或磷脂酰丝氨酸不染色，这将其与经典的细胞外囊泡（如微粒体和外泌体）区分开来。同样，它们也不同于剪切诱导的血小板膜索和流动诱导的突起，后者表达GPIb-IX和活化标志物。我们在促血栓形成表面（胶原）的流动粘附实验中未观察到PITT形成，即有利于血小板活化和血栓形成的条件。

循环血小板可丢失其全部整合素αIIbβ3库

为了在体内研究PITT形成，我们用MWReg30处理小鼠并监测血小板扣押。这种处理会诱导快速的血小板清除和Fc依赖性过敏反应、循环衰竭和肺损伤。这种病理学的一个标志是血小板和含αIIbβ3的免疫复合物样结构在肝脏和脾脏等器官中积累。在WT小鼠中注射MWReg30引起肝脏中血小板的快速积累和严重的血小板减少症，血小板计数在30分钟内降至3%以下，并至少保持低水平48小时。

图3. 小鼠模型中结合的整合素αIIbβ3锚定导致其从血小板主体脱离并沉积于长膜索中。 （A）静脉注射MWReg30后，WT和Fcgr3−/−小鼠的血小板计数监测。（B和C）αIIbβ3的表面表达和结合的MWReg30评估。（D）WT小鼠用MWReg30AF488处理并立即对肝窦成像的截图。（E）注射对照IgG或MWReg3024小时后，Fcgr3−/−小鼠中表面糖蛋白的流式细胞术检测。（F）注射MWReg30AF488后，Fcgr3−/−小鼠血小板的共聚焦图像最大强度投影。（G）MWReg30注射后不同时间点，Fcgr3−/−小鼠血小板裂解物中αIIb和β3表达的蛋白质印迹分析。（H）体外用MWReg30孵育或在Fcgr3−/−小鼠中注射MWReg3024小时后分离的血小板，在聚集仪中用指定激动剂刺激。（I）注射对照IgG或MWReg3024小时后，Fcgr3−/−小鼠血小板的扫描电镜图像。（J）注射对照IgG或MWReg3024小时后，从Fcgr3−/−小鼠分离的洗涤血小板，检测P-选择素暴露和αIIbβ3活化。（K）体外双标记的WT血小板输注到Fcgr3−/−小鼠后，肝窦的CLSM图像截图。（L）输注预染色的WT血小板30分钟后，Fcgr3−/−小鼠肝脏冰冻切片的荧光显微图像。（M）输注血小板30分钟后，Fcgr3−/−小鼠肝脏冰冻切片中非极化、极化、PITT形成血小板和dPITTs的定量。

为了原位观察抗体调理的血小板，我们进行了活体内共聚焦激光扫描显微镜（Intravital Confocal Laser Scanning Microscopy, IV-CLSM）检查。小鼠注射了抗GPIXAF546和抗CD105AF647以标记血小板和肝窦内皮细胞（Liver Sinusoidal Endothelial Cells, LSECs），随后注射MWReg30AF488。几乎立即，MWReg30调理的血小板在LSECs处聚集并表现出快速极化，αIIbβ3在细胞体“后缘”（相对于血流方向）成簇。这些血小板在与LSEC接触的部位延伸出富含αIIbβ3（即PITTs）的长GPIX阴性膜索。

Fcγ受体（Fcγ Receptor, FcγR）III在小鼠清除免疫球蛋白G（Immunoglobulin G, IgG）调理的血小板中起关键作用。为了研究PITT释放后血小板的表型，我们因此使用了缺乏FcγRIII的Fcgr3-/-小鼠。在这些动物中，MWReg30调理的血小板最初被募集到肝脏，但血小板计数仅短暂下降，并在6小时内恢复至>80%。然而，尽管血小板数量部分恢复，再循环的血小板表现出快速且进行性的表面αIIbβ3丢失，分别在3小时和24小时有>70%和>95%的受体丢失，而MWReg30结合下降至对照的<2%。CD9水平在24小时下降约50%，αIIbβ3和CD9均在大约7天后通过新生血小板生成恢复到基线水平。相比之下，其他表面受体（GPIb-IX-V、GPVI、CLEC-2、CD84、β1整合素）的水平在24小时基本保持不变。透射电子显微镜（Transmission Electron Microscopy, TEM）进一步证实，在丢失αIIbβ3后重新循环的血小板仍处于静息状态，显示正常的颗粒分布且无伪足形成。

在第1天，αIIbβ3在质膜和内部储存中几乎完全缺失。αIIb和β3的表达减少长达5天，在第7天恢复正常，提示通过PITT释放导致的不可逆整合素丢失。一致地，这些血小板在胶原、凝血酶或ADP刺激下无法聚集。αIIbβ3缺失的血小板仍然发生形状改变和脱颗粒，但缺乏活化的αIIbβ3（JON/APE结合）。从功能上讲，这导致尾部出血时间严重延长，并在FeCl3损伤模型中消除了动脉血栓形成；然而，血小板寿命基本不受影响，类似于在Itgb3−/−小鼠（GT的小鼠模型）中观察到的表型。

肝窦中的库普弗细胞以FcγRIII依赖的方式参与清除IgG调理的血小板。由于这一机制叠加并可能干扰MWReg30诱导的PITT形成，我们在Fcgr3−/−小鼠中进行肝脏IV-CLSM，以在没有清除机制的情况下观察该过程。WT血小板在体外用抗GPIXAF546和MWReg30AF488标记、洗涤后，注射到预先给予抗CD105AF647 mAb的Fcgr3−/−受体小鼠体内。调理的血小板迅速粘附到LSECs上，在接触部位极化形成致密的αIIbβ3簇，并形成大的PITTs。血小板的主体部分几乎不含αIIbβ3但对GPIX均一染色，随后脱离并返回循环，通常在大约5分钟内。值得注意的是，在自由流动的血小板中也观察到αIIbβ3/MWReg30簇，但PITTs仅在附着时形成。分离的PITTs收缩和/或沿血管壁移动，方向常与血流相反。肝脏冰冻切片的定量分析证实，附着在LSECs上的大多数血小板是极化的，处于PITT形成的不同阶段，并且dPITTs很丰富。在所有血小板中，GPIX染色沿质膜保持均一。

我们假设抗αIIbβ3调理的血小板通过FcγRIIB锚定到LSECs上，FcγRIIB是LSECs中大量表达的清道夫受体。事实上，Fcgr3:Fcgr2b双敲除（Double Knockout, DKO）小鼠未能将血小板募集到肝脏，并且在MWReg30处理后未下调αIIbβ3，这与Fcgr3−/−小鼠形成对比。

血小板在炎症部位局部沉积PITTs

在血栓炎症期间，血小板协调免疫细胞运输和活化，以及维持血管屏障功能，并驱动治疗选择有限的疾病（如中风、脓毒症或ARDS）中的器官损伤。尽管αIIbβ3在这些病理中起关键作用，但其潜在机制仍不清楚。我们假设PITTs可能参与血栓炎症细胞募集和组织损伤。为了验证这一点，我们使用了脂多糖（Lipopolysaccharide, LPS）诱导的肺部炎症模型。小鼠鼻内给予LPS或NaCl；4小时后，取肺并通过CLSM分析冰冻切片。我们对αIIbβ3和GPIX进行双重染色。在LPS处理而非NaCl处理的肺中检测到极化和形成PITT的血小板。与对照相比，LPS处理的肺中dPITTs的数量也增加。dPITTs主要附着在内皮细胞（Endothelial Cells, ECs）和/或中性粒细胞上。在鼻内感染金黄色葡萄球菌的小鼠肺中，dPITTs甚至更丰富、更长且结构更复杂。在Itga2bGFP/GFP小鼠中的活体显微镜检查证实了LPS或金黄色葡萄球菌攻击后ECs和中性粒细胞上的PITT形成，尽管较小的直径和肺部运动使可视化在技术上具有挑战性。在感染了小鼠适应型SARS-CoV-2毒株的BALB/c小鼠肺中也观察到显著的PITT形成。这些数据表明，PITT形成是对肺部内毒素血症或感染的血栓炎症反应的一个组成部分。

图4. 小鼠炎症条件下血小板形成和释放PITTs。 （A至C）WT小鼠鼻内给予NaCl、LPS或金黄色葡萄球菌后肺组织冰冻切片染色。（D和E）Itga2bGFP/GFP小鼠鼻内攻击LPS或金黄色葡萄球菌后，肺部活体内CLSM代表性图像。（F至H）WT和vWf−/−小鼠鼻内给予NaCl或LPS后，肺组织分析dPITTs和中性粒细胞浸润。

在炎症部位，ECs释放Weibel-Palade体内容物并暴露vWF多聚体，这一过程可以解释血小板募集和PITT形成。因此，我们使WT和vWf−/−小鼠经受LPS诱导的肺炎症。4小时后，分离肺并通过CLSM分析冰冻切片。WT对照显示，响应LPS，dPITTs和中性粒细胞募集显著增加。相比之下，LPS处理未能诱导vWf−/−小鼠形成dPITTs，并且中性粒细胞浸润减少了约54%。用JON/A-F(ab)2阻断αIIbβ3具有更强的抗炎效果，显著减少了该模型中的中性粒细胞募集、迁移、中性粒细胞胞外陷阱形成（NETosis）和组织损伤，这一过程先前被证明独立于血小板聚集而发生。

αIIbβ3的促炎功能以及在小鼠发炎肺中检测到与PITT相互作用的中性粒细胞，使我们假设血小板可能直接将PITTs沉积到中性粒细胞上以调节其功能。大约6%的脓毒症患者的中性粒细胞被PITTs修饰。这些PITT+中性粒细胞被激活，表现为CD11b、CD66b和CD184表达上调和CD62L下调，并且与PITT阴性（PITT-）中性粒细胞明显不同。为了在体外监测中性粒细胞上的PITT形成，让人中性粒细胞粘附到纤维蛋白上，然后将用CD41a和CD42c标记的血小板全血在流动下灌注过它们。观察到频繁的血小板-中性粒细胞相互作用，PITTs明显沉积在中性粒细胞上。这些事件引发了中性粒细胞内游离钙浓度（[Ca2+]i）的离散和短暂增加，表明细胞活化。在脓毒症患者样本中，PITT形成普遍增加，血涂片中分离的PITTs数量高于对照，并且常伴有血小板-中性粒细胞复合物（Platelet-Neutrophil Complexes, PNCs）和微血栓增加。在某些情况下，血小板将大量PITTs沉积到单个中性粒细胞上，这一现象在相应条件下的小鼠血液中也观察到。

图5. PITTs促进中性粒细胞活化并加重危重患者的炎症。 （A）严重脓毒症患者血液中PITT修饰的中性粒细胞的共聚焦荧光显微镜图像。（B和C）健康对照和脓毒症患者血液中PITT+中性粒细胞的流式细胞术分析。（D）显示人血中PITT形成和沉积到中性粒细胞上的代表性延时图像。（E）根据血小板CD41a水平将患者队列分层为CD41alow和CD41ahigh组，并计算不良结局的比值比。

PITT形成水平与疾病严重程度相关

这些结果表明PITTs直接促进中性粒细胞活化，提示血小板利用这一效应机制促进炎症。我们接着研究了CD41a下调（作为PITT释放的替代指标）是否与患者亚组的疾病严重程度或临床结局相关。CD41a表达降低与更高的SOFA评分、28天死亡率、住院时间以及ARDS的发生相关。CD41a下调也与脓毒症诱导的凝血病（Sepsis-Induced Coagulopathy, SIC）评分和弥散性血管内凝血（Disseminated Intravascular Coagulation, DIC）评分负相关。 相比之下，与感染部位或病原体类型无相关性，提示PITT形成与疾病严重程度相关，但与炎症的根本原因无关。基于这些发现，我们假设低CD41a表达可能识别出有不良结局风险的患者。根据血小板CD41a水平对患者进行分层，我们将最低四分位数定义为CD41alow。该亚组显示出28天死亡率和ARDS的比值比显著增加，将PITT释放增加与不良结局和ARDS发展联系起来。

讨论

我们的研究结果提供了证据，表明在感染和炎症期间，血小板通过PITT形成将其部分αIIbβ3/CD9库沉积到白细胞和活化的内皮细胞上——这一过程不涉及经典的血小板活化，并放大了炎症反应。在小鼠中，αIIbβ3缺失的血小板保留了正常的寿命、形状改变和脱颗粒能力，但它们在血栓形成和止血中表现出有缺陷的粘附功能。出血和血小板功能改变是脓毒症和DIC的标志。先前的研究报道了危重疾病中严重的GPVI信号传导损伤，这与αIIbβ3密度降低以及对αIIbβ3（GPIIb/IIIa）抑制剂在血流下敏感性增加有关。总之，这些发现表明，PITT释放不仅驱动炎症，还可能促成与严重血栓炎症性疾病患者的“耗竭血小板表型”相关的功能障碍和出血风险。

PITT形成需要配体或抗体与αIIbβ3结合，随后将未结合的αIIbβ3募集到生长的膜索中。这强烈暗示（i）结合的αIIbβ3转导信号，促进远处αIIbβ3异二聚体的募集，以及（ii）未占据的αIIbβ3在膜中表现出高侧向迁移率。在粘附细胞中，踝蛋白等蛋白质将β-整合素胞质域连接到细胞骨架，从而实现力的感知、粘附和配体结合的高亲和力整合素的成簇。然而，在静息血小板中，αIIbβ3并未牢固锚定在细胞骨架上——类似于静息的单核细胞，其中只有约5%的β2-整合素LFA-1与细胞骨架相关。高侧向迁移率和配体结合时微簇的形成被认为对白细胞稳定的耐剪切粘附至关重要。然而，中性粒细胞研究表明，β2-整合素（Mac-1）依赖性长膜索的形成促进了粘附，而不依赖于向细胞骨架的由外向内信号传导。这支持了细胞骨架连接对于整合素启动和中亲和力粘附是非必需的模型，而高亲和力整合素主要通过依赖细胞骨架的机制结合配体。这些β2-整合素依赖的膜索可能代表了细长的中性粒细胞源性结构（Elongated Neutrophil-Derived Structures, ENDs）的前体，最近被描述为中性粒细胞滚动过程中形成的亚微米颗粒。这表明PITT形成可能并非血小板独有，而可能是细胞生物学中更普遍的现象。

与PITTs类似，ENDs具有促炎性，在感染期间产生，并在不利于牢固整合素介导的粘附的条件下释放。这些观察表明，这两种结构分别扩展了血小板和中性粒细胞的功能范围，实现了空间上远距离的炎症调节。PITTs中αIIbβ3的高密度——显然处于低或中亲和力状态——指出了该整合素不同于其经典功能的直接促炎作用。一种可能的机制可能是αIIbβ3整合到靶细胞的质膜中。事实上，已有报道中性粒细胞可以从血小板源性微粒体获得αIIbβ3，然后与β2-整合素共定位并增强核因子κB（Nuclear Factor-κB, NF-κB）活化。此外，PITTs可能通过转移其他膜蛋白和细胞质货物来调节靶细胞功能，这些货物的组成可能因巨核细胞和血小板在炎症疾病背景下的转录组谱变化而有很大差异。

总之，我们确定了一种机制，通过该机制血小板将其主要整合素αIIbβ3分离成一个独特的促炎细胞器——PITT。我们发现（部分）整合素缺失的血小板保持活力，处于静息状态，并且不从循环中被清除，但聚集和形成血栓的能力降低。质膜整合素库的这种高度有序分离解释了COVID-19或其他严重炎症患者中αIIbβ3的丢失。我们怀疑过度的PITT形成导致了严重感染、脓毒症或相关病理患者中观察到的出血倾向合并微血管炎症。

参考文献：

Kusch C, Stegner D, Weiss LJ, Nurden P, Burkard P, Johnson D, Bergmeier W, Onursal C, Navarro S, Hackenbroch C, Pfeiffer D, Bonfiglio SI, Meub M, Gross C, Schenk J, Fumagalli V, Mott K, Bender M, Iannacone M, Andres O, Kastenmüller W, Heinze KG, Sauer M, Schulze H, Ley K, Nurden AT, Nieswandt B. Platelet-derived integrin- and tetraspanin-enriched tethers exacerbate severe inflammation. Science. 2026 Jan 22;391(6783):eadu2825. doi: 10.1126/science.adu2825. Epub 2026 Jan 22. PMID: 41570126.

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